Détection du cytomégalovirus (CMV) par PCR numérique dans les échantillons de selles pour les non

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Détection du cytomégalovirus (CMV) par PCR numérique dans les échantillons de selles pour les non

Journal de virologie

Virology Journal volume 19, Article number: 183 (2022) Citer cet article

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La gastro-entérite à CMV est fréquente chez les patients recevant une allogreffe de cellules souches hématopoïétiques et il est difficile de la distinguer de la maladie aiguë du greffon contre l'hôte (aGvHD), qui présente des symptômes très similaires mais nécessite un traitement assez différent. La gastro-entérite à CMV est causée par une infection locale ou une réactivation du CMV dans le tractus gastro-intestinal, tandis que l'aGvHD est due à un rejet immunitaire. L'étalon-or du diagnostic de la gastro-entérite à CMV et de l'aGvHD est la biopsie gastro-intestinale sous endoscopie, qui est invasive et peut potentiellement entraîner des effets secondaires graves. Le test d'échantillons de selles avec une réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) peut être une alternative, tandis que l'application dans les mesures de niveau de trace et la précision ne sont pas toutes suffisamment satisfaisantes dans les recherches rapportées.

Dans cette étude, nous avons conçu une nouvelle méthode qui extrayait l'ADN acellulaire (cfDNA) du surnageant fécal pour effectuer une PCR numérique (dPCR) pour la détection du CMV, analysait les performances et les comparait à l'ADN total extrait par la procédure actuelle. .

Vingt-deux échantillons de selles appariés utilisant deux méthodes d'extraction d'ADN ont prouvé que la méthode d'extraction de cfDNA avait des concentrations d'ADN et un nombre de copies de gène de contrôle nettement plus élevés, ce qui suggère que le cfDNA peut être plus informatif et plus utile pour la détection du segment d'ADN du CMV. L'approche dPCR dans la détection du segment d'ADN du CMV présente également une bonne linéarité (R2 = 0,997) et une sensibilité plus élevée (la limite de détection à 50 % était de 3,534 copies/μL). Quatre-vingt-deux échantillons de selles de 44 patients immunodéprimés ont été analysés, le taux de CMV positif était de 28 %, ce qui indique que plus d'un quart des symptômes gastro-intestinaux chez ces patients peuvent être causés par une infection ou une réactivation du CMV.

Les résultats combinés suggèrent que la détection du CMV par dPCR dans le cfDNA du surnageant de selles est une méthode puissante pour identifier la gastro-entérite à CMV et aide à la prise de décision de traitement clinique.

Les symptômes gastro-intestinaux sont fréquents chez les patients immunodéprimés, tels que ceux recevant une allo-GCSH, causés très probablement par une gastro-entérite à CMV [1] et/ou une aGvHD gastro-intestinale [2]. L'étalon-or du diagnostic de la gastro-entérite à CMV ou de l'aGvHD gastro-intestinale est la biopsie gastro-intestinale, qui est une procédure invasive et peut potentiellement entraîner des effets secondaires graves tels que des saignements gastro-intestinaux ou une perforation [3, 4]. Les méthodes non invasives, telles que la détection de segments d'ADN du CMV par qPCR à partir d'échantillons de selles de patients immunodéprimés, sont considérées comme une substitution potentielle à la biopsie gastro-intestinale [5]. Cependant, aucun consensus bien reconnu n'a été atteint sur la puissance diagnostique de la détection de segments d'ADN du CMV dans les échantillons de selles pour la gastro-entérite à CMV. Plusieurs études ont révélé que les tests de selles basés sur la PCR pour la détection du segment d'ADN du CMV étaient utiles dans le diagnostic de la gastro-entérite à CMV [6,7,8] ou du moins pour l'exclure [5, 9]. D'autres études ont suggéré que la détection du CMV dans les matières fécales était un facteur prédictif non qualifié d'entérite à CMV [10, 11]. Il convient de noter que la procédure d'extraction de l'ADN peut avoir un impact critique sur la détection du CMV dans les échantillons de selles. Premièrement, les échantillons de selles sont une matrice complexe avec différents composants, qui peuvent intervenir avec l'extraction de l'ADN et la réaction PCR [12]. Deuxièmement, la procédure d'extraction d'ADN détermine si le principal type d'ADN du produit est l'ADN total ou le cfDNA, ce qui n'a pas été pleinement pris en compte en ce qui concerne les différences de détection des segments d'ADN du CMV.

Différent de l'ADN génomique (ADNg), le cfDNA existe largement dans tous les fluides corporels, tels que le sérum, l'urine et le surnageant des selles. De nombreuses avancées impressionnantes dans la recherche sur le cfDNA ont été réalisées ces dernières années, en particulier dans le domaine du diagnostic précoce non invasif du cancer et du dépistage prénatal [13]. Le séquençage du cfDNA a également été utilisé pour surveiller l'infection et/ou le rejet après une transplantation pulmonaire et présentait une bonne cohérence avec les résultats cliniques [14]. Cependant, la détection du segment d'ADN du CMV dans le cfDNA extrait d'échantillons de selles pour le diagnostic de l'infection/réactivation intestinale du CMV n'a pas été bien étudiée à ce jour.

La PCR quantitative, qui est considérée comme la technique de référence pour mesurer les niveaux d'ADN, présente certains inconvénients, tels que le recours à la courbe standard et la capacité de tracer la mesure, en particulier dans les zones dépourvues de normes et de mesures de niveau de trace dans une maladie résiduelle minimale et une latence dans infections virales. La PCR numérique, qui est une nouvelle technologie disponible dans le commerce depuis 2011, s'est avérée plus performante que la qPCR dans les tests de dilution pour l'ADN synthétique [15]. En outre, il a également été rapporté que l'approche dPCR était plus performante sur des échantillons de selles sujets à l'inhibition qu'un test qPCR dans la détection du CMV [16].

Nous rapportons ici notre étude sur la détection du CMV basée sur différentes méthodes d'extraction, à la fois à partir d'échantillons de selles. De plus, les performances de la dPCR utilisée dans la détection des segments d'ADN du CMV ont été évaluées. Nous montrons que la détection du CMV dans le cfDNA des selles par dPCR était sensible et pertinente dans le diagnostic de l'infection intestinale à CMV chez les patients immunodéprimés.

Dans cette étude, les patients qui ont reçu une thérapie cellulaire allo-HSCT ou récepteur de l'antigène chimérique T (CAR-T) et qui présentaient des symptômes gastro-intestinaux tels que des douleurs abdominales et une diarrhée durant plus de deux semaines ont été recrutés de 2017 à 2020. L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'hôpital Tongji, Tongji Medical College, Université des sciences et technologies de Huazhong (TJ-IRB20180809). Le consentement éclairé a été obtenu des participants. Les échantillons de selles aqueuses ont été placés dans des récipients stériles et envoyés au laboratoire immédiatement une fois collectés, stockés à 4 ° C pendant une courte période, puis traités dans les 8 h suivant le prélèvement.

Nous avons filtré les échantillons de selles aqueuses avec un tissu filtrant de 300 mesh et centrifugé les échantillons à 3000 tr/min pendant 10 min, pris le surnageant et centrifugé à nouveau 10 min pour éliminer le composant tangible. Les deux méthodes ont été démarrées avec 1 ml de surnageant fécal. L'ADN acellulaire et l'ADN total ont été extraits à l'aide d'un kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (numéro de catalogue 55114 ; Qiagen, Valencia, CA, USA) et d'un mini kit QIAamp DNA Stool (numéro de catalogue 51504 ; Qiagen, Valencia, CA, USA), respectivement , en suivant les instructions du fabricant et les deux volumes d'élution étaient de 25 µL. La concentration d'ADN a été mesurée par un fluorimètre Qubit 3.0 (Kit de test Qubit dsDNA HS ; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ou un spectrophotomètre NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) si la concentration était hors de la plage du Fluorimètre Qubit (0–10 ng/µL). Les échantillons d'ADN ont été immédiatement utilisés dans des expériences de test ou stockés à - 20 ° C après extraction.

Des sondes et des amorces ciblant la région conservée pour IE1 (gène 1 de la protéine précoce innée) du CMV et le gène de référence de la protéine RNase P nucléaire humaine POP4 ont été conçus à l'aide du logiciel Primer Express version 3.0.1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) et synthétisé par Sangon Biotech Company (Shanghai, Chine). Les séquences des amorces CMV étaient les suivantes : sens 5′-GTGATCCATGTGCTTATGACTTTGT-3′, sens inverse 5′-GCCTTGGTCACGGGTGTCT-3′ et sonde 5′-FAM-ATCATGTGTTTAGGCCC-MGB-3′. Les séquences des amorces de référence étaient les suivantes : sens 5′-GGCGGTGGTCCTGGGAGTACT-3′, sens inverse 5′-AGAGGCCTTTGGCTTTCTTCTT-3′ et sonde 5′-VIC-ACCCGGCCACAAGC-MGB-3′. Les longueurs des amplicons CMV et POP4 étaient de 64 bp et 68 bp, respectivement.

L'approche dPCR a été réalisée comme décrit précédemment [17]. En bref, un mélange réactionnel composé de 10 µL 2× ddPCR Supermix (sans dUTP ; Bio–Rad, Hercules, USA), des amorces (1 µL, 10 µmol/L), des sondes marquées par fluorescence (2 µL, 2,5 µmol/L), et 2 µL de matrice d'ADN (plage de 0,6 à 66 ng) ont été chargés dans un système de PCR Quantalife QX200 Droplet Digital (Bio–Rad, Hercules, USA), le volume total du mélange réactionnel était de 20 µL. Des gouttelettes d'eau dans l'huile ont été générées dans des cartouches à huit puits à l'aide du générateur de gouttelettes QX200 et transférées dans une plaque en polypropylène à 96 puits, qui a été scellée avec du papier d'aluminium. La plaque a ensuite été placée dans un thermocycleur ABI (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les conditions étaient les suivantes : 95 °C pendant 5 min, suivis de 40 cycles de 95 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 1 min (pas plus de 2,5 °C/seconde de rampe), avec un maintien de 10 min à 98 °C et un maintien final à 4 °C. Après PCR, les résultats ont été lus par un lecteur de gouttelettes QX200 et analysés dans le logiciel QuantaSoft version 1.7.4 selon les instructions du fabricant. Chaque réaction a été analysée individuellement, et les seuils ont été ajustés manuellement si nécessaire et adaptés séparément pour les canaux fluorescents. Les résultats finaux du nombre de copies dans les échantillons originaux ont été présentés en copies/mL pour le segment d'ADN CMV et le gène de référence par défaut (fichiers supplémentaires 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).

La séquence cible du CMV a été connectée au vecteur plasmidique pUC57 pour construire un plasmide standard afin de tester la capacité quantitative, et le plasmide recombinant a été transformé dans E. coli DH5α pour achever la prolifération. Le plasmide recombinant a été extrait et purifié à l'aide du kit EndoFree Plasmid Maxi (numéro de catalogue 12362 ; Qiagen, Valence, Californie, États-Unis) et a été quantifié avec le spectrophotomètre NanoDrop, puis le nombre de copies a été calculé avec une concentration, une masse moléculaire et une constante d'Avogadro connues. Le plasmide recombinant a été linéarisé par les enzymes de restriction HindIII (numéro de catalogue R0104S; NEB, USA) et BamHI (numéro de catalogue R0136S; NEB, USA), en préservant la séquence cible CMV intacte sur le plasmide linéarisé. Des dilutions en série au quintuple ont été réalisées à des concentrations allant d'environ 10 000 copies/µl à 3,2 copies/µl et soumises à une dPCR. Chaque concentration de standard a été répétée trois fois dans les mêmes conditions pour déterminer la linéarité quantitative.

3 mL d'échantillons de sang total anticoagulés à l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ont été prélevés puis centrifugés à 3000 tr/min pendant 5 min pour récolter 100 µL de plasma pour la détection de l'ADN du CMV. Les échantillons de plasma ont été traités et l'ADN du CMV a été testé conformément aux instructions du kit de détection de qualification de fluorescence HCMV PCR (gène Daan, Guangzhou, Chine).

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel statistique R v4.0.5. Le test des rangs signés de Wilcoxon sur des échantillons appariés, le test exact de Fisher et le test du chi carré de Pearson ont été utilisés dans des situations spécifiques, le cas échéant.

Pour prouver si la méthode d'extraction d'ADN est importante dans la détection de segments d'ADN CMV, nous avons comparé les concentrations d'ADN et le nombre de copies de gènes de contrôle entre des échantillons de selles identiques appariés à l'aide de deux méthodes d'extraction d'ADN. Le cfDNA a été extrait par un kit QIAamp Circulating Nucleic Acid, marqué comme Kit 1. L'ADN total a été extrait par un QIAamp DNA Stool Mini Kit, qui a été marqué comme Kit 2. Vingt-deux échantillons de selles ont été prélevés chez des patients présentant une variété de maladies et états cliniques. Chaque échantillon a été séparé en deux parties avec des volumes égaux et a subi l'extraction de cfDNA et d'ADN total séparément. Étonnamment, avec le même volume d'élution, la concentration de cfDNA a largement dépassé celle de l'ADN total apparié (Fig. 1A). Ensuite, nous avons détecté le nombre de copies de gène de contrôle dans le cfDNA et l'ADN total extrait d'échantillons appariés et avons constaté que le nombre de copies de gène de contrôle était nettement plus élevé dans le cfDNA que dans les extraits d'ADN total (Fig. 1B). De plus, le gène de contrôle n'a pas été détecté dans 3 des 22 extraits d'ADN totaux, mais pas dans les extraits d'ADNc. Ces résultats suggèrent que la méthode d'extraction de l'ADN a un effet notable sur l'efficacité de l'extraction de l'ADN et que le cfDNA peut être plus abondant et plus utile pour la détection de micro-organismes pathogènes que l'ADN total dans des échantillons spéciaux, tels que des échantillons de selles.

Comparaison appariée entre le cfDNA et l'ADN total extrait des mêmes échantillons de selles à l'aide de deux kits d'extraction distincts. A Les points représentent les concentrations de cfDNA et d'ADN total, et les échantillons d'ADN extraits des mêmes spécimens sont liés par des lignes grises. Les points B représentent le nombre de copies du gène de référence dans les échantillons d'ADN, et ceux extraits des mêmes spécimens sont liés par des lignes grises

Avant l'application aux échantillons cliniques, un test de validation a été effectué en utilisant un contrôle positif avec les deux segments CMV et POP4 et un contrôle négatif avec uniquement des segments POP4 pour tester la spécificité des amorces et des sondes pour détecter l'ADN du CMV et le gène de référence. Les contrôles positifs et négatifs avaient un signal POP4, tandis que seul le contrôle positif avait un signal CMV (Fig. 2). Pour tester les performances supplémentaires de l'approche dPCR dans la détection de segments d'ADN CMV, nous avons établi une norme de segment d'ADN CMV par dilution en série quintuple du plasmide contenant le segment d'ADN CMV d'une concentration de 10 000 copies/μL à 3,2 copies/μL. Comme prévu, les nombres de copies mesurés du segment d'ADN du CMV étaient assez proches des nombres de copies prédits (Fig. 3A). Le R au carré de la régression linéaire des nombres de copies mesurés était de 0,997. La LOD50 (limite de détection à 50%) indique la concentration à laquelle la moitié des échantillons positifs peuvent être détectés. Pour déterminer la LOD50 de l'approche dPCR pour la détection du segment d'ADN du CMV, nous avons d'abord préparé une concentration standard de 80 copies/μL à partir de 10 000 copies/μL par dilution en série au quintuple, des dilutions en série au double ont ensuite été réalisées pour obtenir des concentrations allant de 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625 et 0,313 copies/μL.

Échantillons de contrôle négatifs et positifs de la détection de segments d'ADN du CMV. Les lignes magenta indiquent le seuil de fluorescence défini pour distinguer les gouttelettes positives et les gouttelettes négatives. Les gouttelettes grises sont des gouttelettes sans signal. Les gouttelettes vertes sont des gouttelettes avec un signal positif pour POP4. Les gouttelettes bleues sont des gouttelettes avec un signal positif pour l'ADN du CMV. Les gouttelettes rouges sont des gouttelettes avec les deux signaux pour l'ADN POP4 et l'ADN CMV. A Contrôle négatif d'un donneur sain. B Contrôle positif d'un patient donneur déjà diagnostiqué avec une infection à CMV

L'estimation des performances de la détection des segments d'ADN du CMV par dPCR. Une comparaison du nombre de copies de segments d'ADN CMV détectées et prédites. L'axe des x montre le nombre de copies de segment d'ADN CMV prédit des standards, qui peut être estimé par le degré de dilution de la solution brute avec une concentration connue du segment d'ADN CMV. L'axe des ordonnées montre le nombre exact de copies de segments d'ADN CMV détectés des standards. Chaque triangle rouge représente une détection, et chaque degré de dilution correspond à trois triangles rouges. La ligne verte représente la courbe de meilleur ajustement. B La probabilité de détection du segment d'ADN du CMV à de faibles concentrations. L'axe des x montre la concentration du segment d'ADN du plasmide CMV et l'axe des y montre la probabilité de détection. Le triangle rouge représente la probabilité de détection calculée en divisant le nombre total d'expériences par le nombre d'expériences positivement détectées. La ligne verte représente la meilleure courbe d'ajustement non linéaire

Chaque échantillon standard a été testé 8 fois et le taux de détection positif a été calculé. Une régression non linéaire a été effectuée pour les taux positifs à différentes concentrations avec une valeur de fitness R au carré de 0, 98 (Fig. 3B). La LOD50 a ensuite été calculée à 3,534 copies/μL, et le CMV a pu être détecté avec plus de 50 % de chance lorsque la concentration du segment d'ADN du CMV dans les échantillons était supérieure à cette valeur.

Nous avons appliqué l'approche dPCR établie pour détecter le segment d'ADN du CMV dans des échantillons de selles de patients immunodéprimés. Au total, 44 patients ont été inclus dans notre étude, parmi lesquels 33 recevaient une thérapie allo-HSCT, 9 recevaient une thérapie cellulaire CAR-T et 2 recevaient à la fois une thérapie cellulaire CAR-T et une thérapie allo-HSCT. Onze des patients ont participé à des essais cliniques d'immunothérapie séquentielle CD19/22 CAR-T, qui a été récemment rapportée dans Blood [18]. Les caractéristiques cliniques détaillées des patients sont présentées dans le tableau 1. Quatre-vingt-deux échantillons de selles ont été prélevés chez ces patients lorsqu'ils présentaient des douleurs abdominales et des symptômes de diarrhée qui ne pouvaient pas être contrôlés par l'application à court terme de médicaments antidiarrhéiques tels que la berbérine et la poudre de montmorillonite. . Nous avons analysé le taux d'échantillons de selles positifs pour le CMV de patients atteints de différentes maladies primaires et aucune différence significative n'a été trouvée (Fig. 4A, p = 0, 81 par le test exact de Fisher). Selon les différentes méthodes de traitement, le taux de positivité du CMV chez les patients ayant reçu une thérapie cellulaire CAR-T ou une thérapie allo-HSCT n'était pas non plus significativement différent (Fig. 4B, p = 1 par le test exact de Fisher). Le taux total de positivité était de 28 %, ce qui indique que plus d'un quart des symptômes gastro-intestinaux chez ces patients immunodéprimés peuvent être causés par une infection ou une réactivation du CMV.

Le nombre d'échantillons CMV-positifs et CMV-négatifs dans différents groupes de patients ou d'échantillons. A Les échantillons sont regroupés par différents types de maladies. Les histogrammes présentent les compositions des proportions d'échantillons positifs et négatifs. B Les patients sont regroupés selon le type de traitement principal, à savoir allo-GCSH ou thérapie cellulaire CAR-T. Les histogrammes montrent le pourcentage d'échantillons positifs et négatifs

Le cas 1 (Fig. 5A) était un patient de sexe masculin de 16 ans. Il a reçu un diagnostic de leucémie lymphoïde aiguë en février 2018 et a reçu une allo-HSCT en décembre 2018. Onze jours après la transfusion de cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches transplantées ont été entièrement implantées. Deux mois plus tard, il a soudainement souffert de douleurs abdominales et de diarrhée. Nous nous demandions l'efficacité de l'analyse plasmatique dans l'identification de la gastro-entérite à CMV et la qualité de l'ajustement avec les selles, par conséquent, des analyses plasmatiques ont été effectuées. Le segment d'ADN plasmatique du CMV a été testé immédiatement après l'apparition des symptômes gastro-intestinaux, et le résultat était négatif. La détection de segment d'ADN de CMV fécal à partir de cfDNA a également été effectuée deux jours plus tard et était négative. Les symptômes ont duré plus de deux semaines et l'entéroscopie a été nécessaire pour le diagnostic différentiel. La biopsie entéroscopie et la détection du segment d'ADN du CMV dans les tissus intestinaux ont confirmé qu'il s'agissait d'aGvHD. Après un mois de traitement anti-rejet immunitaire, il a eu des diarrhées moins fréquentes mais a soudainement développé des saignements rectaux. La détection des segments d'ADN du CMV dans le plasma et les selles était positive, ce qui suggérait fortement une gastro-entérite à CMV. En conséquence, l'orientation du traitement s'est déplacée vers la thérapie antivirale. Une semaine après le traitement antiviral, le segment d'ADN du CMV n'a pas pu être détecté dans les échantillons de plasma, mais a conservé un nombre élevé de copies dans les échantillons de selles. Un mois après le traitement antiviral, le segment d'ADN du CMV était négatif dans les échantillons de plasma et de selles. Dans le même temps, les symptômes gastro-intestinaux ont progressivement disparu. Le segment d'ADN du CMV a été surveillé et était négatif pendant plus d'un mois.

Le nombre de copies du segment d'ADN du CMV change à la fois dans le plasma et les selles avec le traitement dans deux cas typiques. A Le cas montre que le segment d'ADN du CMV pourrait être positif dans les selles mais négatif dans le plasma en même temps. B Le cas montre que le segment d'ADN du CMV pourrait être positif dans le plasma mais négatif dans les selles en même temps.

Le cas 2 (Fig. 5B) était une fillette de huit ans qui avait souffert d'anémie aplasique sévère pendant deux mois avant de recevoir une thérapie allo-HSCT. Les cellules souches transplantées ont été entièrement implantées onze jours après la perfusion de cellules souches. Près de 3 mois plus tard, des symptômes persistants de diarrhée sont apparus, le segment d'ADN du CMV étant initialement négatif dans les échantillons de plasma et de selles. L'entéroscopie électronique a montré une congestion diffuse et un œdème dans toute la muqueuse colique, et le CMV et l'EBV étaient négatifs dans la muqueuse intestinale. Ensuite, elle a reçu un traitement immunosuppresseur renforcé pendant plus de 3 semaines avant la détection positive du segment d'ADN du CMV dans le plasma et les selles. Le traitement antiviral a duré une semaine car le segment d'ADN du CMV est devenu négatif dans les selles une semaine plus tard. Un mois plus tard, le CMV plasmatique était à nouveau positif et restait positif pendant plus d'un mois, tandis que le segment d'ADN du CMV était négatif dans les selles tout au long de la période. Avec à la fois un traitement immunosuppresseur renforcé et un traitement antiviral, elle s'est finalement remise de la diarrhée deux mois plus tard.

La thérapie cellulaire allo-HSCT et CAR-T ont toutes deux une importance historique pour les hémopathies malignes. Les patients recevant une thérapie cellulaire allo-HSCT ou CAR-T présentent souvent une gêne gastro-intestinale, une infection ou une réactivation du CMV et une aGvHD, qui sont des complications graves courantes et difficiles à distinguer. De plus, ces complications sont traitées par des traitements très différents et, par conséquent, un diagnostic incertain pose de sérieux défis pour le traitement. Le test traditionnel est la biopsie gastro-intestinale sous endoscopie, qui est une opération invasive qui peut potentiellement entraîner des effets secondaires graves. Des échantillons et des méthodes de détection alternatifs sont nécessaires pour aider à diagnostiquer la gastro-entérite à CMV et à distinguer d'autres maladies du tube digestif.

L'utilisation de cfDNA pour prédire ou diagnostiquer l'infection semble être supérieure aux stratégies traditionnelles telles que les méthodes basées sur la culture en ce qui concerne le délai d'exécution et la précision [14, 19, 20]. Les méthodes basées sur le séquençage sont désormais largement utilisées en clinique et permettent une détection à large spectre des agents pathogènes, mais présentent des inconvénients en ce sens qu'elles sont encore légèrement coûteuses et chronophages. Pour la détection d'agents pathogènes particuliers, les méthodes basées sur la PCR présentent des avantages à la fois en termes d'efficacité et de sensibilité. Comparés au sérum et au plasma, les échantillons de selles sont uniques en raison de leur arrière-plan bactérien massif ainsi que des matériaux de suppression de la PCR. Par conséquent, les méthodes basées sur la PCR sont tout à fait appropriées pour de tels échantillons car elles peuvent minimiser les interférences d'autres agents pathogènes.

Une étude précédente a rapporté que les kits d'extraction d'ADN ont un effet certain sur la qualité de l'ADN, en particulier pour la composition bactérienne par rapport à la Gram-positivité [21]. Les auteurs l'ont attribué aux efficacités de lyse des bactéries Gram-positives par différents kits d'extraction. Lors de l'examen des rapports de détection du CMV pour le diagnostic de la gastro-entérite à CMV, nous avons trouvé des opinions clairement contradictoires sur la puissance diagnostique de la détection du segment d'ADN du CMV dans les échantillons de selles. Fait intéressant, deux rapports concluant que la détection du CMV n'était pas insatisfaisante pour le diagnostic de la gastro-entérite à CMV ont utilisé le même kit d'extraction, le QIAamp DNA Stool Mini Kit. Ce kit a principalement isolé l'ADNg de cellules lysées dans des échantillons de selles. Cependant, si les cellules épithéliales intestinales ne se dissociaient pas trop ou si elles ne pouvaient pas maintenir une structure cellulaire intacte avant le traitement des selles, les segments d'ADN du CMV étaient également absents lors de l'extraction finale de l'ADN, même s'ils se trouvaient réellement dans les cellules. Sur la base de cette hypothèse, nous avons comparé l'extraction de cfDNA et d'ADN total à partir des mêmes échantillons de selles. Nous avons constaté que les concentrations d'ADN étaient beaucoup plus élevées pour le cfDNA que pour l'ADN total, et que le nombre de copies du gène de contrôle était également plus élevé pour le cfDNA que pour l'ADN total. Ce résultat peut s'expliquer principalement par le fait que les cellules épithéliales intestinales ont été largement lysées, apoptosées ou activement sécrétées, libérant du cfDNA dans les selles avec peu de cellules intactes en cas de gastro-entérite.

Une comparaison entre dPCR et qPCR pour la détection quantitative du CMV a été rapportée et a montré que la qPCR avait une sensibilité un peu plus élevée que la dPCR [22], ce qui peut être confondu par l'étendue de l'optimisation de l'approche dPCR. Dans une publication récente de notre centre [17], nous avons montré que les tests dPCR et qPCR avaient de bonnes corrélations pour les standards et les échantillons cliniques, mais que la dPCR montrait une meilleure répétabilité et reproductibilité. Plus important encore, la limite de détection de l'approche dPCR était inférieure à celle de la qPCR lorsque les deux méthodes étaient entièrement optimisées. Par conséquent, nous avons développé une procédure de détection de segment d'ADN CMV basée sur dPCR, et l'évaluation des performances a montré qu'elle avait une précision assez élevée dans la plage de détection. Compte tenu de la spécificité élevée, nous avons également testé la sensibilité en mesurant la LOD50 des standards, notre LOD50 était de 3,534 copies/μL (3534 copies/mL). L'étude de Hayden et al. ont révélé que leur LOD était de 4571 copies/mL pour les normes de l'OMS [22], nous étions à peu près au même niveau. Une optimisation supplémentaire, telle que la quantité de chargement de matrice d'ADN, la concentration de sonde et d'amorces et les conditions de réaction PCR, peut être effectuée à l'avenir.

L'infection ou la réactivation du CMV a été largement étudiée chez les patients recevant une allo-HSCT, mais il manque de données cliniques suffisantes chez les patients recevant une thérapie cellulaire CAR-T. À la connaissance des auteurs, il s'agit du premier rapport qui compare le taux d'infection ou de réactivation du CMV chez les patients recevant une thérapie cellulaire allo-HSCT et CAR-T. Stewart [23] a résumé les complications infectieuses de la thérapie cellulaire CAR-T et a constaté que la réactivation du CMV était rare, même chez les patients sans prophylaxie. Nos données révèlent que le taux d'infection ou de réactivation du CMV était similaire chez les patients recevant une thérapie cellulaire CAR-T et ceux recevant une allo-HSCT. Le taux de CMV-positif était de 30,0 % (3/10) dans les échantillons de patients recevant une thérapie cellulaire CAR-T et de 28,6 % (20/70) dans les échantillons de patients recevant une allo-HSCT, respectivement. Étant donné que la sélection des patients et des échantillons dans notre étude n'était pas impartiale dans l'essai clinique sur les cellules CAR-T, le taux réel d'infection ou de réactivation du CMV devrait être plus faible dans l'ensemble de la cohorte. Néanmoins, nous avons pu en déduire que les symptômes gastro-intestinaux induits par l'infection ou la réactivation du CMV n'étaient pas rares chez les patients recevant une thérapie cellulaire allo-HSCT ou CAR-T. Nous avons également évalué la relation entre le taux d'infection ou de réactivation du CMV et le temps écoulé depuis la réception de la thérapie cellulaire allo-HSCT ou CAR-T. Comme prévu, le taux d'infection ou de réactivation du CMV n'a pas montré de tendance claire au fil du temps chez les patients présentant des symptômes gastro-intestinaux, ce qui pourrait s'expliquer par l'état immunodéprimé soutenu.

Pour clarifier si les échantillons de selles peuvent être remplacés par des échantillons de plasma pour détecter l'infection ou la réactivation du CMV, nous avons comparé les nombres de copies de segments d'ADN du CMV dans les échantillons de selles et ceux des échantillons de plasma correspondants prélevés en même temps et avons décrit en détail deux cas particuliers pour illustrer le problème. Nous avons constaté que les résultats de détection des deux spécimens ne correspondaient pas bien, ce qui indiquait qu'ils ne pouvaient pas être représentés l'un par l'autre. Par conséquent, il est nécessaire de tester des échantillons de selles plutôt que du plasma lorsqu'une maladie gastro-intestinale liée au CMV est suspectée, car le plasma est probablement négatif pour la détection des segments d'ADN du CMV. De plus, la surveillance de la charge de CMV à partir d'échantillons de selles a montré des avantages irremplaçables par rapport à la biopsie intestinale, qui est considérée comme l'étalon-or du diagnostic de l'entérite à CMV. Tout d'abord, il s'agit d'une méthode de détection non invasive qui protège les patients contre les dommages supplémentaires et les risques d'infection. Deuxièmement, il est pratique et économique et permet une détection fréquente et continue pour surveiller les changements de condition. À partir des deux cas, nous avons constaté que les symptômes gastro-intestinaux pouvaient ne pas être initiés par une infection ou une réactivation du CMV, mais pouvaient être accompagnés d'une infection ou d'une réactivation ultérieure du CMV, ce qui rendait toujours la condition plus compliquée ; par conséquent, la surveillance de la charge CMV est plus importante à la fois pour la clarification du diagnostic et la prise de décision médicale.

En conclusion, la détection du CMV par dPCR dans le cfDNA du surnageant de selles est une méthode puissante pour identifier la gastro-entérite à CMV, qui présente une efficacité et une sensibilité plus élevées et aide à la prise de décision de traitement clinique.

Les données et le matériel sont disponibles sur demande raisonnable de l'auteur correspondant.

Cytomégalovirus

Greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques

Maladie aiguë du greffon contre l'hôte

ADN sans cellule

PCR numérique

Réaction en chaîne par polymérase quantitative

ADN génomique

Cellule T réceptrice d'antigène chimérique

Gène 1 de la protéine précoce innée

Limite de détection à 50

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